Après le Conservatoire national supérieur d’art dramatique de Paris, Denis Podalydès entre en 1997 dans la troupe de la Comédie-Française et en devient le 505^e sociétaire en 2000. La même année, il reçoit le Molière de la Révélation théâtrale pour son rôle dans Le Revizor de Gogol par Jean-Louis Benoît. Il a marqué de son interprétation quelques grands rôles du répertoire parmi lesquels Harpagon dans L'Avare par Catherine Hiegel, Fortunatov dans La Forêt d’Ostrovski, Matamore dans L’Illusion comique par Galin Stoev, Orsino dans Les Nuit des rois ou Tout ce que vous voudrez puis le rôle-titre dans Le Roi Lear par Thomas Ostermeier ou encore Oscar Ekdahl dans l’adaptation de Fanny et Alexandre d’Ingmar Bergman par Julie Deliquet. Ivo Van Hove le choisit pour le Baron Konstantin von Essenbeck dans Les Damnés d’après Visconti, Badalucco et Medioli, puis Ménélas dans Électre / Oreste d’après Euripide et, enfin, Orgon dans Tartuffe ou l’Hypocrite de Molière. Tiago Rodrigues lui confie le double-rôle du comédien jouant Agamemnon et celui du Procureur dans la pièce écrite pour la Troupe Hécube, pas Hécube.

Dirigé par Brigitte Jaques-Wajeman, Jacques Lassalle, Jean-Pierre Miquel, Philippe Adrien, Pascal Rambert, Matthias Langhoff, Dan Jemmett ou David Lescot, Denis Podalydès est à son tour metteur en scène avec des pièces qui font date : Cyrano de Begerac de Rostand – qui remporte six Molières en 2007 dont ceux de la mise en scène et du meilleur spectacle du théâtre public –, Lucrèce Borgia d’Hugo, Ce que j'appelle oubli de Mauvignier, Fantasio de Musset, Les Fourberies de Scapin de Molière. Et il signe en 2026 celle du Cid de Corneille.

Parmi ses mises en scène majeures de théâtre et d’opéra présentées sur d’autres scènes, citons L’Orage d’Ostrovski, La Mort de Tintagiles de Maeterlinck, Le Triomphe de l’amour de Marivaux au Théâtre des Bouffes du Nord, Fortunio de Messager et Le Comte Ory de Rossini à l'Opéra-Comique, Don Pasquale de Donizetti et La Clémence de Titus de Mozart au Théâtre des Champs-Élysées.

Acteur dans plus d’une centaine de films au cinéma depuis le début des années 1980 et une vingtaine pour la télévision, il tourne entre autres pour Bruno Podalydès, Arnaud Desplechin, Bertrand Tavernier, François Dupeyron, Michel Deville, Michaël Haneke, Xavier Durringer, Noémie Lvovsky, les frères Larrieu, Pierre Jolivet, Alain Resnais, Christophe Honoré, Pascal Bonitzer, Costa-Gavras...

Denis Podalydès est également auteur, il signe notamment Voix off (prix Femina Essai 2008), Fuir Pénélope, Les nuits d’amour sont transparentes, En jouant en écrivant, Célidan disparu, L'ami de la famille – Souvenirs de Pierre Bourdieu ou encore l’Album de la Pléiade Shakespeare.