Guillaume Gallienne suit d’abord des études d’histoire avant de se former au métier de comédien au Cours Florent, puis au Conservatoire national supérieur d’art dramatique de Paris. Il entre à la Comédie-Française en 1998 et en devient le 513^e sociétaire en 2005.

Il y interprète Oblomov de Gontcharov dans la mise en scène de Volodia Serre – qu’il adapte pour la télévision en 2017 –, Saint-Just dans La Mort de Danton de Büchner mis en scène par Simon Delétang, ou le Metteur en scène dans Six personnages en quête d’auteur de Pirandello monté par Marina Hands en 2024. À deux reprises, il travaille avec le metteur en scène Ivo Van Hove, dans Les Damnés d’après Visconti, Badalucco et Medioli d’abord, puis dans Le Tartuffe ou l’Hypocrite de Molière, où il interprète Cléante.

Il joue également Argan dans Le Malade imaginaire dans la mise en scène de Claude Stratz et le Maître de philosophie dans Le Bourgeois gentilhomme dirigé par Valérie Lesort et Christian Hecq.

En 2008, il crée Guillaume et les garçons, à table !, mis en scène par Claude Mathieu, qui fait l’objet d’une adaptation cinématographique récompensée par cinq Césars dont celui du meilleur film et du meilleur acteur. En 2020, il présente un second spectacle en solo, François le saint Jongleur de Dario Fo, dans le cadre des Singulis, toujours avec la collaboration de Claude Mathieu.

Au cinéma, il réalise en 2017 son second long métrage, Maryline, avec Adeline d’Hermy. Il tourne dans de nombreux films réalisés par Sofia Coppola (Marie-Antoinette), Danièle Thompson (Fauteuils d’orchestre, Cézanne et moi), Niels Arestrup (Le Candidat), Pascal Thomas (Ensemble, nous allons vivre une très, très grande histoire d’amour), Jalil Lespert (Yves Saint Laurent, Le Dindon), Wes Anderson (The French Dispatch) ou encore Nils Tavernier et Emmanuel Mathieu (La Vie devant moi).

De 2009 à 2019, il anime sur France Inter l’émission Ça ne peut pas faire de mal, consacrée à la littérature.

Il met en scène Huis clos de Sartre à Tokyo dans une version intégrant des éléments du théâtre nô. À l’opéra, il signe les mises en scène de La Cenerentola de Rossini à l’Opéra national de Paris, puis de Pulcinella de Stravinski et L’Heure espagnole de Ravel à l’Opéra-Comique en 2024.

En 2025, il publie Le Buveur de brume aux éditions Stock, dans la collection Une nuit au musée.